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企業(yè)展示在全球藥物研發(fā)格局中，大分子生物藥與小分子藥物形成鮮明技術(shù)路徑差異。小分子藥物多通過(guò)化學(xué)合成制備，作用靶點(diǎn)寬泛、脫靶效應(yīng)相對(duì)較高，且易受細(xì)胞屏障限制；而大分子生物藥（如治療性蛋白/多肽、單克隆抗體、病毒載體基因治療藥物、ADC藥物等）依托生物合成技術(shù)，以靶向性強(qiáng)、療效確切、治療窗口寬為核心優(yōu)勢(shì)，能精準(zhǔn)穿透疾病關(guān)鍵通路，為腫瘤、自身免疫性疾病、罕見病等難治性疾病提供突破性治療方案，已成為創(chuàng)新藥研發(fā)的核心賽道。
但由于大分子生物藥多具有異源性或復(fù)雜大分子結(jié)構(gòu)，易誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫原性，進(jìn)而形成中和抗體（NAb）。中和抗體可通過(guò)阻斷藥物到達(dá)靶標(biāo)或干擾受體/配體結(jié)合，直接削弱藥物體內(nèi)活性，不僅可能導(dǎo)致治療失效，還可能引發(fā)交叉免疫反應(yīng)等安全風(fēng)險(xiǎn)，因此中和抗體檢測(cè)已成為大分子生物藥研發(fā)與臨床應(yīng)用必不可少的一部分。
一、中和抗體的考察場(chǎng)景
臨床研究階段：需滿足NMPA、FDA等監(jiān)管機(jī)構(gòu)申報(bào)要求，支撐給藥方案優(yōu)化與療效相關(guān)性分析； 臨床應(yīng)用階段：患者出現(xiàn)療效不佳、治療失效或免疫相關(guān)不良反應(yīng)時(shí)，需通過(guò)檢測(cè)排查中和抗體影響； 特殊藥物需求：基因治療藥物給藥前需篩查患者預(yù)存中和抗體，避免載體被清除； 一致性評(píng)價(jià)：生物類似藥上市前后需對(duì)比原研藥免疫原性特征，證明臨床安全性與有效性一致性。
二、CBA方法開發(fā)考量點(diǎn)
直接法采用表達(dá)靶受體的細(xì)胞系，通過(guò)檢測(cè)藥物分子與其同源受體直接相互作用所誘導(dǎo)的檢測(cè)信號(hào)來(lái)實(shí)現(xiàn)，中和抗體可阻斷藥物功能，使檢測(cè)信號(hào)減弱，反應(yīng)原理如圖1（左）[1]。間接法除藥物和適配細(xì)胞系外，通常還需配體等額外組分（配體可與細(xì)胞同源受體結(jié)合），配體與受體相互作用可產(chǎn)生檢測(cè)信號(hào)，藥物會(huì)中和配體并使檢測(cè)信號(hào)降低，而中和抗體可抑制藥物的這一中和功能，使檢測(cè)信號(hào)恢復(fù)，反應(yīng)原理如圖1（右）[1]。
一般來(lái)說(shuō)CBA法被監(jiān)管部門認(rèn)為是衡量藥物產(chǎn)生中和抗體的金標(biāo)準(zhǔn)，但在法規(guī)上未做強(qiáng)制要求。根據(jù)藥物的類型和作用機(jī)理、免疫原性風(fēng)險(xiǎn)、方法本身的選擇性、基質(zhì)干擾程度、靈敏度等選擇分析模式，匯總結(jié)果見表1[1]。
采樣時(shí)間避開藥物體內(nèi)濃度峰值，最好采集藥物谷濃度樣本。 血清預(yù)處理，通過(guò)物理方式去除或降低血清中的藥物濃度。 調(diào)整試驗(yàn)參數(shù)，如調(diào)整樣本MRD、孵育時(shí)間、細(xì)胞密度、藥物干擾檢測(cè)信號(hào)時(shí)更換檢測(cè)方法等。為了保證試驗(yàn)的可重復(fù)性及準(zhǔn)確性，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程最好使用同一品牌、同一貨號(hào)的試劑，比如培養(yǎng)基、胎牛血清、檢測(cè)試劑盒等，如有可能盡量避免使用不同批次的試劑，減少批次帶來(lái)的信號(hào)波動(dòng)。試驗(yàn)耗材也需確保無(wú)菌，避免影響細(xì)胞活性或抗原抗體結(jié)合。
三、Nab方法驗(yàn)證內(nèi)容
方法開發(fā)完成后，需對(duì)方法進(jìn)行完整驗(yàn)證，主要包括臨界值、鉤狀效應(yīng)、精密度、選擇性、靈敏度、耐藥性、穩(wěn)健性等[2-6]。方法臨界值一般采用固定臨界值，當(dāng)試驗(yàn)存在明顯變異時(shí)，也可采用浮動(dòng)臨界值。靈敏度無(wú)具體規(guī)定，可參考ADA的指導(dǎo)原則。不同于ADA的穩(wěn)健性驗(yàn)證，NAb還需額外考慮細(xì)胞傳代數(shù)、培養(yǎng)基批次對(duì)結(jié)果的影響。
中和試驗(yàn)一般僅對(duì)ADA檢測(cè)為陽(yáng)性的樣本進(jìn)行檢測(cè)，通常不進(jìn)行確證試驗(yàn)。對(duì)于ADA陽(yáng)性樣本檢測(cè)一般采用1%的假陽(yáng)性率，當(dāng)使用中和活性對(duì)個(gè)體進(jìn)行篩選時(shí)，應(yīng)采用5%假陽(yáng)性率[2]。
四、案例分析：GLP-1/GIP受體激動(dòng)劑NAb檢測(cè)
目前全球已有1個(gè)GLP-1/GIP雙重受體激動(dòng)劑獲批上市，多個(gè)GLP-1/GIP、GLP-1/GCG雙重和GLP-1/GIP/GCG三重受體激動(dòng)劑處于臨床開發(fā)階段。
有濟(jì)醫(yī)藥針對(duì)GLP-1及GIP分別建立了基于CBA法的NAb檢測(cè)方法，選擇了高表達(dá)人GIPR受體的細(xì)胞株以及高表達(dá)人GLP1R受體的細(xì)胞株，通過(guò)GIPR激動(dòng)劑或GLP1R刺激劑驅(qū)動(dòng)熒光素酶表達(dá)系統(tǒng)。在沒(méi)有激動(dòng)劑的情況下，GIPR/GLP1R受體不被激活，發(fā)光信號(hào)低。在激動(dòng)劑存在的情況下，以劑量依賴的方式檢測(cè)到GIPR/GLP1R途徑激活的發(fā)光。
細(xì)胞種板培養(yǎng)，待測(cè)樣本經(jīng)過(guò)預(yù)處理后與一定濃度的藥物共孵育，一同加入細(xì)胞中，藥物與細(xì)胞表面的靶點(diǎn)結(jié)合，刺激細(xì)胞產(chǎn)生熒光素酶。有NAb存在時(shí)，NAb與藥物結(jié)合阻斷藥物與細(xì)胞表面的靶點(diǎn)結(jié)合，最后加入熒光素酶檢測(cè)試劑，信號(hào)強(qiáng)度與樣品中NAb的濃度在一定范圍內(nèi)呈負(fù)相關(guān)。
通過(guò)對(duì)細(xì)胞鋪板密度（見圖2）、孵育時(shí)間的優(yōu)化，在不同藥物濃度下確定了EC50，GIP藥物響應(yīng)曲線如圖3所示，GLP-1藥物響應(yīng)曲線如圖4所示。方法開發(fā)過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)LPC濃度下藥物耐受大約為100 ng/mL，PK檢測(cè)結(jié)果顯示最高藥物濃度大約為450 ng/mL，藥物耐受水平差會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果，通過(guò)優(yōu)化成功將耐藥性提高至850 ng/mL，提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確性。對(duì)方法進(jìn)行完整驗(yàn)證，包括臨界值、靈敏度、鉤狀效應(yīng)、精密度、藥物耐受性、選擇性、系統(tǒng)適用性、穩(wěn)健性的考察，各項(xiàng)指標(biāo)均符合接受標(biāo)準(zhǔn)。
圖2 細(xì)胞密度的選擇
圖3 GIP藥物響應(yīng)曲線；圖4 GLP-1藥物響應(yīng)曲線結(jié)語(yǔ)
有濟(jì)醫(yī)藥已建成覆蓋多類大分子生物藥的中和抗體檢測(cè)平臺(tái)，具備從細(xì)胞系篩選、方法開發(fā)、全項(xiàng)驗(yàn)證到樣品檢測(cè)的一站式服務(wù)能力，以高特異性、高靈敏度、高合規(guī)性的技術(shù)方案，助力創(chuàng)新生物藥加速上市進(jìn)程。
